http://www.bioon.com 生 物 谷 网 站前一阵子一直在做双酶切质粒重组，失败了 很多次，不过很快改善了 实验方法，用2周重组了 14个质粒。现就自己的体会，结合丁香园战友的宝贵经验，谈一下质粒重组的一些个人经验。
1、回收PCR产物：在进行PCR扩增时候，给引物两端设计好酶切位点，一般说来，限制酶的 选择非常重要，尽量选择粘端酶切和 那些酶切效率高的限制酶，如BamHI,HindIII,提前看好各公司的双切酶所用公用的BUFFER，以及各酶在公用BUFFER里的效率。选好酶切位点后，在各个酶的两边加上保护碱基，其原则可参照：http://img.dxy.cn/upload/2006/08/13/31219184.pdf。
双酶切时间及其体系：需要强调的是很多人建议酶切过夜，其实完全没有必要，我一般酶切3个小时，其实1个小时已经足够。应用大体系，如100微升。
纯化问题：纯化PCR产物割胶还是柱式，我推荐柱式，因为割胶手法不准，很容易割下大块的胶，影响纯化效率。现在的柱式纯化号称可以祛除引物，既然如此，酶切掉的几个碱基肯定也会被纯化掉了。所以，PCR产物和双酶切产物的纯化均可应用柱式纯化。我用的是TAKARA的纯化柱试剂盒
酶量的问题：以TAKARA的为例，其对1单位酶的定义如下：在50 μl 反应液中，30℃温度下反应1小时，将1 μg 的λDNA完全分解的酶量定义为1个活性单位(U)。 而该酶浓度约为15单位/微升，在除外酶降解的 因素外，该酶可分解15μg的DNA，而一般从1-4ml菌液提出的 DNA约为3μg，而PCR纯化后的产物（50体系）约为3μg，所以即便全部加进去，只要纯化的 质量好，酶切完全切得动。
2、酶切、回收后的PCR产物与载体的连接
摩尔比的计算，很多人凭经验也可以。但对于初学者从头认真计算则 非常有必要。回收的载体片段：回收的PCR产物片段=1：10　，一般取前者0.03pmol，后者取0.3pmol。
pmol为单位的DNA转换为为µg单位的DNA：（X pmoles×长度bp×650）/ 1,000,000 （注：长度bp×650是该双链DNA的分子量）所得数值即为µg,也可以直接用这个公式套.1pmol 1000bp DNA=0.66μg,如载体是5380bp，则0.03pmol为
0.03×5.38×0.66=0.106524µg。
测DNA浓度可以在专用机子上测，注意OD值，一般约1.8-2.0.另外，如果嫌麻烦，也可用MARKER进行估测，如MARKER2000，5微升的 MARKER每个条带约50ng。
连接反应：TAKARA的 连接酶上的 说明写的过夜，而其对连接酶单位的定义为：在20 μl的连接反应体系中，6 μg的λDNA-Hind III的分解物在16℃下反应30分钟时，有90%以上的DNA片段被连接所需要的酶量定义为1个活性单位（U）。而它的浓度为350 U/μl ，所以完全够用。连接酶容易失活，注意低温操作，最好在冰上。时间3个小时足已。
3、转化：
a、全量（10 μl）加入至100 μl JM109感受态细胞中，冰中放置30分钟。
b、42℃加热45秒钟后，再在冰中放置1分钟。
c、加入890 μl AMP阴性培养基，37℃振荡培养60分钟。
取100μl铺板。也可离心后余100μl

几个非常重要的问题
1 做转化的时候,进行酶连接反应时,注意保持低温状态,因为LIGASE酶很容易降解.为保险起见,一般连接3小时,16度.
2 对含有AMP-RESISTENCE的质粒铺板时,注意加AMP时的温度,温度过高,会使克隆株无法筛选出来.我的方法是培基高温消毒后放在烤箱里，烤箱一般温度为55-60度，然后做的时候拿出来，这样好掌握温度。铺板前后注意用吹风机吹干
3对照的设立：
为验证双酶切是否成功,可做如下对照:
A 酶切反应时加各单酶分别切,两管,用同一种BUFFER,跑胶,看单切的两管是否成线性.如两管均成线性可初步判断双酶切成功.
做转化时,也要进行对照.
设4个:
A.即拿双酶切的质粒产物也进行连接反应,这个对照可进一步看双酶切是否成功,如果长出克隆,说明很有可能只进行了单酶切,如没长出克隆,则证明双酶切成功,当然要保证感受态,培基,连接酶都'正常'的情况下.
B.酶切过的未进行连接反应的双酶切产物,进行转化,这一步可以证明是否有残留的未被任何酶切的原始质粒
C.设原始质粒为对照,意为检测整个操作过程中是否有误.
D.AMP阴性板上用同一批感受态细胞铺板20微升足够,检测感受态状况.
4.所有的试剂切记低温保存.一步一个脚印.不要偷懒,图省事最后却更费事.注意设立对照。
经PCR鉴定，克隆90%-100%的阳性率，所以在后面的 挑克隆中，我只挑选4个就足够了。然后双酶切鉴定，测序。。。。。。
希望大家不断补充。

我就叫她小小猪。

每天十点才起床，

两眼仍是迷糊糊。

小猪就爱啃猪蹄，

我说“相煎何太急”。

米饭至少吃二两，

还得加根火腿肠。

]]> 2006-12-10T21:37:53Z http://danceforever.bokee.com/5930220.html Windows XP安装一年多了，最近发现系统运行速度明显慢了下来，用了很多优化软件、卸载已经安装的软件都无济于事。为了找出症结所在，笔者先查看了Windows XP所在区的磁盘空间，发现Windows文件夹占用的空间大了不少。笔者随即进入Windows各文件夹看看有没有奇怪的文件，查看到“Windos\Prefetch”文件夹(即Windows预读文件夹)时，发现里面有上百个以PF为扩展名的文件，不由得心里一动:难道是它的问题?试着将里面的文件清空，重新启动计算机后，发现系统运行速度居然正常了!
　　原来，预读设置虽然可以提高系统速度，但是使用一段时间后，预读文件夹里的文件会变得很多，导致系统搜索花费的时间变长。而且有些应用程序会产生死链接文件，加重了系统搜索的负担。因此，我们应该定期删除这些预读文件。

　　当然，Windows XP也允许我们设置预读的对象。方法是:打开注册表编辑器，依次展开HKEY_LOCAL_MACHINE\SYSTEM\CurrentControlSet\Control\Session Manager\Memory Management\PrefetchParameters分支，在右侧窗口中双击“EnablePrefetcher”，在打开的“DWORD”值编辑窗口中，可以对Windows XP进行预读设置:


　　将该值设置为“0”，即为取消预读功能;设置为“1”，系统将只预读应用程序;设置为“2”，系统将只预读Windows系统文件;设置为“3”，系统将预读Windows系统文件和应用程序。一般我们将该值设置为“2”即可，当然，如果你的计算机配置很高，也可以将该值设置为“3”，以加快系统运行速度。

　　我们也可以自己制作一个批处理程序，在每次开机时删除“Windows\Prefetch”文械奈募热缥颐切陆ㄒ桓雒狣elPre.bat文件，然后用记事本打开它，加入以下内容:

　　del %SystemRoot%\Prefetch\*.* /q

　　加“/q”参数是删除全局通配符时，不要求确认，当然还可以用其他参数，如“/f”参数是强制删除只读文件。然后保存文件，记住在保存对话框的“保存类型”中选择“所有文件”。将它放置到启动组中即可。

　　1、加速网上邻居

　　在Windows XP中访问网上邻居是相当恼人的，系统会搜索自己的共享目录和可作为网络共享的打印机以及计划任务中和网络相关的计划任务，然后才显示出来，显然这样速度就会比Windows 9x中慢很多。其实这些功能我们并没有使用上，与其不用还不如删除它们，这样速度就会明显加快。打开注册表编辑器，找到HKEY_LOCAL_MACHINE/sofeware/Microsoft/Windows/ Current Version/Explore/RemoteComputer/NameSpace，删除其下的{2227A280-3AEA-1069-A2DE08002B30309D}(打印机)和{D6277990-4C6A-11CF8D87- 00AA0060F5BF}(计划任务)，重新启动电脑，再次访问网上邻居，你会发现快了很多。

　　2、减少开机滚动条时间

　　每次启动Windows XP，蓝色的滚动条都要走上好多次，其实这里我们也可以把它的滚动时间减少，以加快启动速度。打开注册表编辑器，找到HKEY_LOCAL_MACHINE\SYSTEM\CurrentControlSet\Control\Session Manager\Memory Management\PrefetchParameters，在右边找到EnablePrefetcher主键，把它的默认值3改为1，这样滚动条滚动的时间就会减少。

　　3、加快开机速度

　　在XP中关机时，系统会发送消息到运行程序和远程服务器，告诉它们系统要关闭，并等待接到回应后系统才开始关机。加快开机速度，可以先设置自动结束任务，首先找到HKEY_CURRENT_USER\Control Panel\Desktop，把AutoEndTasks的键值设置为1;然后在该分支下有个“HungAppTimeout”，把它的值改为“4000(或更少)，默认为50000;最后再找到HKEY_LOCAL_MACHINE\ System\CurrentControlSet\Control\，同样把WaitToKillServiceTimeout设置为“4000”;通过这样设置关机速度明显快了不少。

　　4、去掉菜单延迟

　　为了达到视觉上的真实感，Windows XP中的菜单在打开时会有滑出的效果，但这也会延缓打开速度。我们可以在HKEY_CURRENT_USER\Control Panel\Desktop下找到“MenuShowDelay”主键，把它的值改为“0”就可以去掉菜单延迟效果。

　　5、提高宽带速度

　　专业版的Windows XP默认保留了20%的带宽，其实这对于我们个人用户来说是没有什么作用的。尤其让它闲着还不如充分地利用起来。

　　在“开始→运行”中输入gpedit.msc，打开组策略编辑器。找到“计算机配置→管理模板→网络→QoS数据包调度程序”，选择右边的“限制可保留带宽”，选择“属性”打开限制可保留带宽属性对话框，选择“禁用”即可。这样就释放了保留的带宽，对于上网的朋友是非常有用的。
]]> 2006-12-06T09:27:21Z http://danceforever.bokee.com/5919114.html 首先向这个机场表示强烈的BS一下！

作为一个普通的公民，应该有权利乘坐中国的航空飞机吧。不好固定，那是你们机场的事情。乘客就是顾客，就是上帝。机场方面应该想办法满足乘客的需要，而并非拒绝！

即使机场有权利拒绝他登机，但是，作为一个自强不息的典型，他为全社会很多处于困境中的人作出了很好的榜样和模范作用。他本身的精神是难能可贵的！！而机场反而以不好固定这样的理由来拒绝登机。两方面的反差是多么的大呀！

我就纳闷了：都是中华民族大地上的炎黄子孙，这做人的差距咋就这么大呢！！！

再次BS！！！！

恳请各位哥哥姐姐弟弟妹妹们，能不能给个idea。

只要是关于食品方面的都行，小弟先谢谢大家了^_^

后来发现，整个博客，就没有一点自己的东西，郁闷，这个究竟怎么玩？